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大鼠Ⅲ型膠原（Col Ⅲ）定量檢測(cè)試劑盒（ELISA）
【試劑盒用途】
定量檢測(cè)大鼠血清、血漿、組織液及其它相關(guān)液體樣本中Ⅲ型膠原（Col Ⅲ）的含量。
【檢測(cè)原理】
本試劑盒采用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。將標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本加入到預(yù)
先包被大鼠Ⅲ型膠原（Col Ⅲ）單克隆抗體透明酶標(biāo)包被板中，溫育足夠時(shí)間后，洗滌除去
未結(jié)合的成分，再加入酶標(biāo)工作液，溫育足夠時(shí)間后，洗滌除去未結(jié)合的成分。依次加入底
物A、B，底物（TMB）在辣根過氧化物酶（HRP）催化下轉(zhuǎn)化為藍(lán)色產(chǎn)物，在酸的作用下
變成，顏色的深淺與樣品中大鼠Ⅲ型膠原（Col Ⅲ）濃度呈正相關(guān)，450nm 波長下測(cè)定
OD 值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的OD 值，計(jì)算樣本中大鼠Ⅲ型膠原（Col Ⅲ）含量。
【試劑盒組成】
1 酶標(biāo)包被板12 孔×8 條7 顯色劑A 液6mL
2 標(biāo)準(zhǔn)品0.3mL×6 管8 顯色劑B 液6mL
3 20 倍濃縮洗滌液25mL 9 終止液6mL
4 樣本稀釋液6mL 10 說明書1 份
5 特殊稀釋液6mL 11 封板膜2 張
6 酶標(biāo)試劑6mL 12 密封袋1 個(gè)
備注：標(biāo)準(zhǔn)品（1 號(hào)→6 號(hào)）濃度依次為：12、6、3、1.5、0.75、0.375 μg/L.
【需要而未提供的試劑和器材】
1、37℃恒溫箱
2、標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
3、精密移液器及一次性吸頭
4、蒸餾水
5、一次性試管
6、吸水紙
【操作步驟】
1、準(zhǔn)備：從冰箱取出試劑盒，室溫復(fù)溫平衡30 分鐘。
2、配液：用蒸餾水將20 倍濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液。
3、加標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本：取足夠數(shù)量的酶標(biāo)包被板，固定于框架上，分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、
待測(cè)樣本孔和空白對(duì)照孔，記錄各孔位置，在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品50μL；待測(cè)樣本孔中先
2
加入待測(cè)樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL（即樣本稀釋5 倍）；空白對(duì)照孔不加。
4、溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。
5、洗板：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙
上拍干，如此重復(fù)洗板4 次（也可用洗板機(jī)按說明書操作洗板）。
6、加酶標(biāo)工作液：每孔加入酶標(biāo)工作液50μL，空白對(duì)照孔不加。
7、溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。
8、洗板：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙
上拍干，如此重復(fù)洗板4 次（也可用洗板機(jī)按說明書操作洗板）。
9、顯色：每孔先加入顯色劑A 液50μL，再加入顯色劑B 液50μL，平板混勻器混勻30s
（或用手輕輕震蕩混勻30s），37℃避光顯色15min。
10、終止：取出酶標(biāo)板，每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)（顏色由藍(lán)色立轉(zhuǎn)）。
11、測(cè)定：以空白孔調(diào)零，在終止后15 分鐘內(nèi)，用450nm 波長測(cè)量各孔的吸光值（OD 值）。
12、計(jì)算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD 值，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣
本的OD 值，在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度，也可以使用各種應(yīng)用軟件來計(jì)算。zui終濃
度為實(shí)際測(cè)定濃度乘以稀釋倍數(shù)。
【樣本要求】
1、樣本不能含疊氮鈉（NaN3），因?yàn)榀B氮鈉（NaN3）是辣根過氧化物酶（HRP）的抑制劑。
2、標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能立即
試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3、樣本應(yīng)充分離心，不得有溶血及顆粒。
【注意事項(xiàng)】
1、實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)。
2、酶標(biāo)包被板開封后如未用完，應(yīng)立即裝入密封袋中加干燥劑保存。
3、建議所有的標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和空白對(duì)照都做雙份檢測(cè)，取平均值，以減小實(shí)驗(yàn)誤差。
4、牢記樣本已經(jīng)稀釋5 倍，計(jì)算結(jié)果乘以5 才是樣本實(shí)際濃度。
5、本試劑盒定量范圍為0.375-12μg/L，超過此范圍，為標(biāo)準(zhǔn)曲線延伸計(jì)算所得，不做為準(zhǔn)
確定量結(jié)果，請(qǐng)用特殊稀釋液稀釋后測(cè)定準(zhǔn)確結(jié)果（0.375-12μg/L 范圍內(nèi)），乘以總稀釋倍數(shù)
即為樣本zui終濃度。
6、若顯色過淺，可適當(dāng)延長底物溫育時(shí)間。
7、為避免交叉污染，標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和空白對(duì)照每加一個(gè)就要更換一次吸頭；酶標(biāo)工作液、
樣本稀釋液和底物等公共組分，要懸臂加樣，不得碰到微孔；不得重復(fù)使用封板膜。
8、試劑盒保質(zhì)期內(nèi)使用，不同批號(hào)的試劑不得混用。
9、底物B 對(duì)光敏感，避免長時(shí)間暴露于光下。
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【操作程序總結(jié)】
準(zhǔn)備試劑，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品
加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37℃反應(yīng)30 分鐘
洗板4 次，加入酶標(biāo)試劑，37℃反應(yīng)30 分鐘
洗板4 次，加入顯色液A、B，37℃顯色15 分鐘
加入終止液
15 分鐘之內(nèi)讀OD 值
計(jì)算
【檢測(cè)范圍】
0.375μg/L - 12μg/L
【規(guī)格】
96T/盒
【貯藏】
2-8℃，避光防潮保存。
【有效期】
6 個(gè)月